2019年底在湖北省武漢市爆發(fā)的新型冠狀病毒被列為乙類傳染病，具有高傳染性，按照國(guó)家規(guī)定，需采用甲類傳染病的預(yù)防，控制措施。

    那么，怎樣在“金標(biāo)準(zhǔn)”核酸檢測(cè)方法下做好病毒檢測(cè)工作呢？

    根據(jù)目前研究已知，該病毒基因組大小約為30kb，具有ORF1a/b非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)；結(jié)構(gòu)蛋白E（Envelop），M（膜蛋白），N（核衣殼），S（表面蛋白）編碼區(qū)；輔助蛋白o(hù)rf 3, 6, 7a, 7b, 8和9b編碼區(qū)。因此，檢測(cè)的探針引物設(shè)計(jì)必須保證準(zhǔn)確性和特異性。羅氏的TIB檢測(cè)試劑盒在設(shè)計(jì)時(shí)，參照已發(fā)表的病毒基因組序列設(shè)計(jì)了三組探針引物，分別是E基因，RdRP基因（位于ORF1ab）和N基因。其中E基因保守性強(qiáng)，用于初步篩查；RdRP基因特異性強(qiáng)，用于COVID-19（WHO最新命名）的檢測(cè)；N基因特異性較強(qiáng)，用于復(fù)檢防止漏檢，也可檢測(cè)類SARS病毒。整體設(shè)計(jì)比較嚴(yán)謹(jǐn)合理，符合當(dāng)下的檢測(cè)需要。

    當(dāng)拿到檢測(cè)試劑盒后，又要怎樣開展實(shí)驗(yàn)?zāi)?？下面是一個(gè)簡(jiǎn)易的流程圖：

    首先，樣本采集。樣本類型主要分為呼吸道樣本，血液樣本和糞便樣本。

    呼吸道樣本：

    1. 上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子，鼻咽或口咽抽吸物或洗液等。

    2. 下呼吸道標(biāo)本：支氣管肺泡灌洗液、呼吸道抽取物、痰液和肺組織活檢標(biāo)本。

注意： 拭子標(biāo)本只能用帶有鋁桿或塑料桿的人造合成拭子頭（例如聚酯纖維或滌綸）收集。不允許使用木桿的海藻酸鈣或棉質(zhì)的拭子頭。

    血液樣本：

    盡量采集發(fā)病后7天的急性期抗凝血。采集量5 ml， 以空腹為佳，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管血液。

    糞便樣本：

    出現(xiàn)腹瀉癥狀的患者需采集糞便標(biāo)本（肛門拭子）。

   （同時(shí)，要注意的是，標(biāo)本采集后在4℃最多保存72小時(shí)；如果不能及時(shí)檢測(cè)，則將標(biāo)本在-70 ℃或以下保存；提取的核酸應(yīng)在-70℃或以下保存。）

    再次，是樣本前處理。

    根據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委的建議，要經(jīng)過(guò)56℃，30分鐘的滅活處理；或者按照WHO的方案，可加入含有（硫氰酸胍，異硫氰酸胍）胍鹽的裂解液，高溫孵育， 60℃ 60 min。為了最大程度上保證實(shí)驗(yàn)人員的安全，推薦使用羅氏提供的MagNA Pure 96 External lysis buffer（含胍鹽）進(jìn)行外部裂解與滅活。

    然后，進(jìn)入到核酸提取階段，分為手工提取法和全自動(dòng)核酸提取。

    核酸提取是整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中比較關(guān)鍵的步驟，若提取效果不佳，會(huì)影響到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果分析。

    手工提取可以采用市售各品牌手提試劑盒，也可以選擇羅氏的High Pure Viral RNA Isolation Kit手提試劑盒，該試劑盒采用的是柱式提取法，效果比較穩(wěn)定。

    全自動(dòng)核酸提取會(huì)越來(lái)越多應(yīng)用在臨檢部門，特別是針對(duì)這種突發(fā)情況，可以做到在短時(shí)間大批量（1個(gè)小時(shí)96個(gè)樣品）的開展核酸提取工作。我們推薦的病毒核酸自動(dòng)提取方案如下：

（其中設(shè)備下的提取Protocol全部經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可以滿足此次疫情的核酸提取需要。）

    接下來(lái)，得到滿足檢測(cè)要求的核酸后，就可以開展定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本了。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室的要求，對(duì)樣本的布板可以采取以下形式：

注意：1. NTC至少1個(gè)；PC一個(gè)；陽(yáng)性質(zhì)控品開蓋前離心，防止污染。

      2. 室間質(zhì)評(píng)：NC三個(gè)隨機(jī)放置；LPC 一個(gè)

（北京市開展新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)質(zhì)量控制的工作方案（試行第一版）

    在熒光定量PCR儀上的設(shè)置按如下程序進(jìn)行：

    反轉(zhuǎn)錄，55℃，5min——預(yù)變性，95℃，5min——擴(kuò)增，95℃，5s；60℃，15s，采集信號(hào)；72℃，15s（45Cycler）——冷卻，40℃，30s。

可適用于羅氏品牌下的LightCycler 480 I，LightCycler 480 II，LightCycler 96和Cobas Z480等機(jī)型上。

   結(jié)果的判讀，遵循綜合判定法，即：

   最后為實(shí)驗(yàn)后的消毒處理，所有操作臺(tái)面用75%酒精或其他消毒液噴灑消毒，所有個(gè)人防護(hù)用品經(jīng)高壓滅菌后處理，放入三層醫(yī)療廢物袋中集中處理。（可參考北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)布的個(gè)人防護(hù)方案和檢測(cè)后處理方案。）